熒光定量PCR分析儀（qPCR儀）憑借其高靈敏度、高特異性和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能力，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，在基因表達(dá)分析方面具有重要應(yīng)用。

qPCR通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)基因在mRNA水平上的表達(dá)量，結(jié)合內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除樣本間RNA提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率等差異，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的相對(duì)定量。

差異表達(dá)分析：比較不同處理?xiàng)l件（如藥物處理、環(huán)境刺激）或不同發(fā)育階段（如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化）下目標(biāo)基因的表達(dá)變化。例如，研究炎癥因子在巨噬細(xì)胞激活前后的表達(dá)差異。
疾病機(jī)制研究：通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織與正常組織中癌基因（如EGFR、HER2）或抑癌基因（如p53）的表達(dá)量，揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
藥物作用機(jī)制：分析藥物處理后細(xì)胞中特定基因（如凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2）的表達(dá)變化，評(píng)估藥物療效及作用靶點(diǎn)。

 

實(shí)驗(yàn)流程：從樣本處理到數(shù)據(jù)獲取的關(guān)鍵步驟

樣本采集與處理
組織/細(xì)胞樣本：迅速裂解細(xì)胞或組織，提取總RNA（需避免RNA降解，可使用RNase抑制劑）。
血液樣本：分離外周血單核細(xì)胞（PBMC）或血漿，檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）或循環(huán)游離DNA（cfDNA）中的基因表達(dá)。
逆轉(zhuǎn)錄（RT）
將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用隨機(jī)引物或基因特異性引物。逆轉(zhuǎn)錄效率需通過(guò)內(nèi)參基因驗(yàn)證，確保cDNA質(zhì)量。
qPCR反應(yīng)體系配置
引物與探針設(shè)計(jì)：引物需跨越內(nèi)含子（避免基因組DNA污染），探針需與目標(biāo)序列完全匹配。可通過(guò)NCBI Primer-Blast或OligoArchitect等工具設(shè)計(jì)。
反應(yīng)條件優(yōu)化：調(diào)整退火溫度、Mg²?濃度、引物濃度等參數(shù)，確保擴(kuò)增效率在90%-110%之間（通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算）。
上機(jī)運(yùn)行與數(shù)據(jù)采集
使用96孔或384孔板，設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照，NTC）和陽(yáng)性對(duì)照。運(yùn)行程序包括預(yù)變性、循環(huán)擴(kuò)增（40-50個(gè)循環(huán)）和熔解曲線分析（SYBR Green法）。